Приложение «Нанотехнологии в онкологии»
к журналу «Онкохирургия» за 2012 год. Том 4, номер 1

17 декабря 2011 г., Москва ФГБУ, МНИОИ им. П.А. Герцена Минздрава России

• Номер 1
• Номер 2
• Номер 3
• Номер 4

Особенности получения опухолеспецифичных белковых векторов на основе БТШ70 для создания пептидно-нуклеотидных комплексов с регуляторными свойствами

Абрамов А.А.¹, Шустова О.А.², Клинкова А.В.²

¹ Москва, ИПК ФМБА
² Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН), Москва, Россия

Нуклеотиды с регуляторными свойствами являются одним из перспективных инструментов, используемых в настоящее время для создания противоопухолевых препаратов. Действие одного из видов нуклеотидов – миРНК, основано на феномене РНК-интерференции, заключающийся в способности двухцепочечных молекул миРНК прицельно блокировать синтез определенных белков. Несмотря на то, что миРНК считается перспективным подходом к разработке новых лекарственных препаратов, доставка терапевтических миРНК в клетки-мишени является сложной задачей.

РНК быстро элиминируются, и для обеспечения эффективности необходимо создание нетоксичных частиц-носителей, способных доставить миРНК в клетки-мишени, не вызывая при этом развития иммунного ответа. Одной из транспортных систем, которая может быть использована для доставки миРНК, является белок теплового шока 70 кДа (БТШ70). Это связано с особенностями структуры БТШ70, обеспечивающей данным протеинам способность образовывать прочные комплексы с белками, пептидами и другими молекулами, а также проникать через клеточные мембраны.

Существенно, что транспортные свойства БТШ70 реализуются как в случае комплексов, так и конъюгатов этих белков с различными типами молекул. Очень важным для рассматриваемой проблемы является также высокий уровень консервативности БТШ70, что обусловливает практически полное отсутствие иммуногенности у этой молекулы. В наших исследованиях было показано, что существенное количество БТШ70, достаточное для получения и последующего тестирования конъюгированного препарата, может быть выделено, если при культивировании клеток различных тканей обеспечивается их продолжительная жизнеспособность и проводится гормональное стимулирование синтеза БТШ70.

Для выделения белка мы используем модифицированный метод аффинной хроматографии БТШ70 с помощью АТФ-агарозы. Следующим шагом является моделирование различных вариантов конструирования пептидно-нуклеотдиных комплексов с белковой частью, состоящей из БТШ70. Созданные компьютерные модели позволяют сделать предположение о прочности и конформационной подвижности некоторых вариантов связей БТШ70-миРНК в составе пептидно-нуклеотидных нанокомплексов, способствующей проникновению этих комплексов в клетки-мишени.

Таким образом, полученные нами результаты позволяют сделать предположение о возможной перспективности использования БТШ70 как белкового вектора для доставки миРНК молекул в составе пептидно-нуклеотидных комплексов, наряду с другими имеющимися сегодня системами доставки миРНК.

Нанодисперсные порошки фосфатов кальция для медицинских применений

Баринов С.М., Комлев В.С., Фадеева И.В., Бакунова Н.В., Фомин А.С.

Учреждение Российской академии наук Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова РАН, Москва, Россия

Фосфаты кальция применяют в медицине для лечения поврежденных костных тканей благодаря их химическому и фазовому подобию неорганической составляющей костной ткани. В последнее время разработан регенеративный подход, в рамках которого акцент делается не на механическое замещение биоматериалом костной ткани, а на регенерацию последней в месте дефекта [1, 2]. Биоматериалу в таком случае отводят роль матрикса для роста костной ткани de novo и активного источника необходимых для построения костной ткани элементов, лишь первоначально осуществляющего опорную функцию.

В рамках регенерационного подхода от биоматериалов требуются, прежде всего, увеличение скорости биодеградации материала в организме, для согласования ее со скоростью образования новой костной ткани [1]. В связи с этим, ведется поиск альтернативы чистому гидроксиапатиту (ГА), который имеет низкую скорость резорбции в тканях организма. Более резорбируемым материалом является трикальцийфосфат (ТКФ), химические и биологические свойства которого могут быть модифицированы замещением ионов кальция другими катионами, в частности катионами физиологически важных элементов.

Исследованы две технологии синтеза нанодисперсных серебро-, цинк-, медьзамещенных трикальцийфосфатов – осаждение из растворов солей и гетерофазное взаимодействие с использованием механохимической активации. Полученные соединения исследованы методами рентгенофазового анализа, ИК спектроскопии, электронной микроскопии и элементного анализа. Установлено, что все полученные порошки являются однофазными и имеют структуру β-трикальцийфосфата.

Ионы серебра, цинка и меди входят в структуру β-ТКФ. Установлено, что размер частиц катионзамещенных β-ТКФ зависит от природы и количества иона-заместителя, а также от метода синтеза. Порошки, полученные осаждением, имеют существенно меньший размер по сравнению с порошками, полученными гетерофазным синтезом.

Исследована растворимость материалов в изотоническом растворе, выявлено, что насыщение изотонического раствора ионами кальция для катионзамещенных ТКФ наступает через 14 суток, в то время как для ГА – через 60 суток. Кроме того, концентрация ионов кальция в изотоническом растворе, содержащем ТКФ замещенные, вдвое выше по сравнению с ГА. Таким образом, полученные порошки ТКФ замещенных имеют более высокую растворимость по сравнению с ГА и могут быть использованы для изготовления пористых матриксов, предназначенных для инженерии костных тканей.

Работа выполнена при поддержке РФФИ, грант РФФИ 11-03-12083-офи_м.

1. Hench L.L., Polak J.M. Third-generation biomedical materials. Science. 2002; 295: 1014-1017.
2. Баринов С.М., Комлев В.С. Биокерамика на основе фосфатов кальция. М.: Наука, 2005; 204.

Биодеградируемые кальцийфосфатные цементы на основе α- и β-трикальцийфосфата для замещения дефектов костных тканей

Баринов С.М., Комлев В.С., Фадеева И.В., Кряжков И.И., Макарова А.Б., Тетерина А.И., Тютькова Ю.Б.

Учреждение Российской академии наук Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова РАН, Москва, Россия

В настоящей работе приведены результаты по разработке пористых кальцийфосфатных цементов на основе α-трикальцийфосфата (α-ТКФ) и β-трикальцийфосфата (β-ТКФ) с контролируемой скоростью биодеградации. Трикальцийфосфат получали осаждением из растворов нитрата кальция и двухзамещенного фосфата аммония. Для кристаллизации α-ТКФ полученные в результате синтеза порошки подвергали термической обработке при 13000С в течение 2 часов.

Для получения β –ТКФ температуру термообработки понижали до 8000С. В качестве затворяющих жидкостей использовали раствор фосфорной кислоты, содержащей соли цинка и алюминия (ЗЖ1) и раствор фосфатов магния в фосфорной кислоте (ЗЖ2). При твердении цемента в случае α-ТКФ происходит реакция (1), что подтверждается данными РФА:
α – Ca3(PO4)2 + H3PO4 + 2H2O • 3CaHPO4 • 2H2O (1)

Время схватывания – 3-4 мин, время твердения – до 15 мин. рН цемента увеличивается по мере протекания реакции между порошком и жидкостью, достигая через 15 мин нейтральных значений рН 6,9 - 7,4. Прочность цементов зависит от вида ЗЖ: для ЗЖ1 – 30 МПа, для ЗЖ2 – 5-7 МПа. Структура цементов различается в зависимости от состава порошка – при введении в состав цементного порошка карбонатов калия или кальция формируются взаимосвязанные поры размером 20-30 мкм, применение в качестве порообразователя карбоната аммония увеличивает размер пор до 100 мкм. Прочность такого цемента снижается до 2,5 МПа.

В случае использования β -ТКФ и ЗЖ2 в процессе твердения в цементном тесте происходит реакция (2):
Са(Н2РО4)2 • Н2О + Са3(РО4)2 + 7Н2О • 4СаНРО4∙2Н2О (2)

Время схватывания – до 3 мин. Введение в состав цементного порошка карбоната кальция позволяет получить цемент, имеющий нейтральную реакцию (рН=7,0-7,4). Прочность цемента при этом снижается до 1 МПа.

Материалы могут найти применение при замещении или регенерации дефектов костных тканей, в частности, в онкологии.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 11-03-12127-офи_м.

РПАН-Лф – препарат нового поколения для детоксикационной терапии на основе псевдоаденовирусных частиц: фармакодинамика и фармакокинетика

Безбородова О.А.¹, Немцова Е.Р.¹, Кармакова Т.А.¹, Якубовская Р.И.¹, Тутыхина И.Л.², Шмаров М.М.², Логунов Д.Ю.², Народицкий Б.С.²

¹ ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Минздравсоцразвития России»,
² ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ, Москва, Россия

На основе псевдоаденовирусных частиц, экспрессирующих ген лактоферрина (Лф) человека, разработан отечественный препарат нового поколения РПАН-Лф (рекомбинантные псевдоаденовирусные наночастицы, несущие ген Лф человека), предназначенный для профилактики и купирования интоксикаций различной этиологии.

В экспериментах in vitro показано, что РПАН-Лф продуцирует в культуре клеток 293 рекомбинантный Лф человека с молекулярной массой, равной 76,0±0,5 kDa, с антигенными, антибактериальными и антиоксидантными свойствами, аналогичными таковым у природного Лф человека, выделенного из донорского женского молока (препарат «Лапрот»).

В экспериментах in vivo на интактных мышах показано, что РПАН-Лф, при его однократном внутривенном введении, осуществляет доставку гена Лф в организм животного, обеспечивая высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка в течение 30-ти суток. По данным иммуногистохимического исследования рекомбинантный Лф человека после введения РПАН-Лф, секретируется гепатоцитами и поступает в кровоток через систему венозных сосудов печени.

При однократном введении РПАН-Лф в дозе 4,3x1011частиц/м2 максимальная концентрация рекомбинантного Лф человека в крови животных поддерживается в течение 3-х дней, в отличие от нативного Лф человека в составе препарата «Лапрот», который элиминируется из организма в течение 3-х часов. Показатель времени полувыведения рекомбинантного Лф превышает таковое в 105 раз нативного Лф при введении препарата «Лапрот» и составляет 8,4 и 0,08 суток, соответственно, что характеризует значительную пролонгацию препарата в кровотоке.

В экспериментах in vivo определена эффективность РПАН-Лф в качестве детоксицирующего агента, которая выражалась в снижении летальности, в значительном уменьшении степени выраженности и длительности клинических проявлений тяжелой экзогенной интоксикации, вызванных введением ксенобиотиков, а также в сохранении функциональной активности печени и почек по данным биохимического анализа крови.

Работа выполнена при финансовой поддержке ООО «НТФАРМА».

Новый противоопухолевый препарат на основе комплекса цисплатина (платизид)

Будынина Е.М., Тамм М.Е., Кондаков С.Э., Мельников М.Я.

Химический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова, НОЦ «Химическая физика биохимических и биологических процессов», Москва, Россия

Поиск новых водорастворимых соединений платины, обладающих противоопухолевой активностью, наряду с поиском новых транспортных форм наноразмерного диапазона для известных фармацевтических препаратов является актуальной задачей фармацевтической химии [1]. Мы предположили, что перспективными для разработки новых противоопухолевых лекарственных средств являются исследования в области синтеза новых и модификации известных препаратов на основе комплексных соединений платины и биотропного лиганда, содержащего в своей структуре пиридиновый фрагмент.

Используя предложенный подход, было синтезировано новое комплексное соединение цисплатина (цис-диаминдихлорплатина) формулы:
Pt(NH3)2Cl2•2L,
где L=INH (изониазид, гидразид изоникотиновой кислоты – используемый противотуберкулезный препарат), названное нами платизид.

Разработанный препарат (платизид) сохраняет свою активность для всех опухолевых процессов, где для лечения применяется цисплатин, но отличается пониженной токсичностью и высокой растворимостью, что облегчает его использование и позволяет отказаться от стадии лиофилизации в процессе получения готовой лекарственной формы.

1. De Pascali S.A. et all New water-soluble platinum(II) phenanthroline complexes tested as cisplatin analogues: First-time comparison of cytotoxic activity between analogous four- and five-coordinate species. Dalton Trans. 2006; 42: 5077-87.

Применение препарата «Колетекс-гель-ДНК» для лечения и профилактики лучевых реакций у больных раком шейки матки

Вельшер Л.З., Демидова Л.В., Коробкова Л.И., Коробкова А.Ю.

Кафедра онкологии и лучевой терапии МГМСУ, Москва, Россия

Заболеваемость раком шейки матки в России составляет 9.3 на 100 тыс. населения, а смертность 4.9 на 100 тыс. населения. Последние десятилетия отмечен рост заболеваемости среди молодых женщин. Ведущим методом лечения больных раком шейки матки является комплексное лечение, важным компонентом которого является лучевая терапия. У 40% пациентов развиваются лучевые реакции со стороны влагалища, мочевого пузыря и прямой кишки, что ведет к вынужденным перерывам в лечении и, как следствие, к ухудшение его результатов. Разработка более эффективных препаратов для профилактики и лечения лучевых реакций и осложнений является крайне важной медико- социальной задачей. Таким препаратом является российский гидрогелевый «Колетекс-гель-ДНК», представляющий собой лечебную композицию дерината в альгинате натрия.

Цель. Изучить эффективность использования российского «Колетекс-гель-ДНК» для местного применения, обеспечить непрерывность курса лучевой терапии за счет снижения количества и степени выраженности лучевых реакций путем применения нового гидрогелевого препарата.

Материалы и методы. Применение гидрогелевого «Колетекс-гель-ДНК» для профилактики и лечения лучевых реакций со стороны слизистых оболочек влагалища, прямой кишки и мочевого пузыря при проведении лучевой терапии по поводу рака шейки матки. Оценка эффективности будет проведена по шкале RTOG по степени интенсивности.

Результаты и обсуждение. В отделении радиологии ЦКБ №2 им. Семашко, отделе лучевой терапии ФГУ «МНИОН им. Герцена» 40 женщинам в возрасте от 26-70 лет, средний возраст составил 49.5 лет, проводилась лучевая терапия с использованием «Колетекс-гель-ДНК» с первых дней облучения. У всех диагноз был подтвержден при гистологическом исследовании и соответствовал Ib-IIIB стадиям. Лучевые реакции по шкале RTOG по степени интенсивности выявлены 1-2 степени. Это позволило произвести лечение без перерыва, что привело к уменьшению пребывания больных в стационаре по сравнению со стандартными методами профилактики и лечения лучевых реакции.

Выводы. «Колетекс-гель-ДНК» может быть использован в практическом здравоохранении для лечения и профилактики лучевых реакций и осложнений при использовании лучевой терапии для лечения больных раком шейки матки.

Экспериментальное обоснование применения лазерного излучения при резекции почки

Вельшер Л.З., Стаханов М.Л., Тарасова Л.Б., Русанова А.Г., Горчак Ю.Ю., Васильева О.А.

Кафедра онкологии и лучевой терапии МГМСУ,
Онкологический центр ОАО РЖД,
Кафедра патологической анатомии лечебного факультета МГМСУ,
Кафедра патологической физиологии стоматологического факультета МГМСУ, Москва, Россия

Введение. С целью определения эффективности использования лазерного излучения длиной волны 970 нм, генерируемого аппаратом ЛСП «ИРЭ-Полюс» модели ЛСП-0,97/10, нами проведено экспериментальное исследование. Цель исследования: сравнительный анализ морфологических изменений тканей почки при ее лазерной и традиционной резекции. Материалы и методы. На базе кафедры патофизиологии стоматологического факультета МГМСУ воспроизведен эксперимент на 100 половозрелых крысах-самцах линии Вистар. В эксперименте участвовало 2 группы животных.

50 животным первой группы выполнена резекция почки излучением длинной волны 970 нм лазерного аппарата ЛСП «ИРЭ-Полюс» модели ЛСП-0,97/10. 50 животным второй группы выполнена стандартная резекция почки. Гистологическое исследование осуществляли на базе кафедры патологической анатомии лечебного факультета МГМСУ после последовательного выведения животных обеих групп из эксперимента: через 30 мин. после выполнения резекции, а также на 2,7,16,24,31,40 сутки. Результаты исследования.

В результате исследования гистопрепаратов ткани почки в случае лазерной резекции выявлены три зоны повреждения: 1) зона тотальной деструкции, протяженностью 0.3-0.7 мм, 2) зона реактивно-деструктивных изменений протяженностью 0.8-2.3 мм, 3) переходная зона, с незначительной сосудистой реакцией. На 2-е сутки, выделенные 1-я и 2-я зоны, сохраняют прежнюю толщину, без воспалительной инфильтрации, тромбоз сосудов микроциркуляторного русла. К 7 суткам отмечено уменьшение размеров очагов некроза с формированием соединительно-тканных волокон. На 16-е сутки очаги некроза заместились соединительнотканными волокнами.

На 24-е сутки на отдельных участках сформировались тонкостенные микро-сосуды, а на 31-е сутки отмечено формирование «нежного» рубца без деформации органа. Морфологические изменения почки после традиционной резекции характеризуются: формированием обширных кровоизлияний и тромбоза сосудов микроциркуляторного русла, а так же развитием ишемических инфарктов, активацией пролиферации фибробластов ко 2-м суткам эксперимента. К 7-м суткам отмечено усиление склеротических процессов, наличие выраженной лейкоцитарной инфильтрации.

Развитие грубых соединительнотканных волокон отмечено к 16-м, 24-м суткам эксперимента и формирование грубого рубца на 31-е, 40-е сутки. Заключение. Сравнительный анализ результатов гистологического исследования показал, что воздействие высокоэнергетическим лазерным излучением длинной волны 970 нм на паренхиму почки может являться перспективным для применения в клинической практике.

Применение лазерного флуоресцентного исследования в диагностике у онкологических больных

Вельшер Л.З., Стаханов М.Л., Цалко С.Э., Решетов Д.Н.

Онкологический центр ОАО «Российские железные дороги»,
Кафедра онкологии и лучевой терапии МГМСУ, Москва, Россия

Цель исследования. Оценить диагностическую значимость лазерного флуоресцентного исследования в дифференциальной диагностике различных опухолей. Материалы и методы. Оценку точности флуоресцентной диагностики осуществляли путем сравнения результатов лазерного флуоресцентного и морфологического исследований пигментных и беспигментных опухолей кожи, опухолях щитовидной железы. Исследовали 359 пигментных и беспигментных опухолей кожи различной локализации, а также 54 опухоли щитовидной железы. Для реализации метода лазерного флуоресцентного исследования использовали аппаратный комплекс с лазером красного диапазона спектра длиной волны 635 нм.

Удаление опухолей осуществляли по общепринятым методикам. Для определения злокачественного или доброкачественного характера новообразования мы производили сравнительный анализ двухмерных лазер-индуцированных флуоресцентных изображений опухолей: непосредственно опухолей кожи и операционных макропрепаратов опухолей щитовидной железы. Результаты. При морфологическом исследовании опухолей кожи 69 опухолей оказались злокачественными (рак и меланома кожи), 290 – доброкачественные (пигментные невусы, фибромы и пр.), 20 опухолей щитовидной железы имели злокачественную природу, 34 были доброкачественными.

При лазерном флуоресцентном исследовании из 69 наблюдений злокачественных опухолей кожи характер образования правильно определен в 64 (92,75%) в 5 наблюдениях получен ложноотрицательный результат (7,25%). Из 290 доброкачественных опухолей кожи правильно определен характер опухоли в 279 наблюдениях (96,2%), ложноположительный результат получен в 11 наблюдениях (3,8%).

Из 20 раковых опухолей щитовидной железы при лазерном флуоресцентном исследовании правильно характер образования установлен в 19 наблюдениях (95%), в 1 наблюдении (5%) получен ложноотрицательный результат. Ложноположительный результат при исследовании 34 доброкачественных опухолей щитовидной железы получен в 4 наблюдениях (11,8%).

Результаты биоэлектротерапии больных раком простаты

Вельшер Л.З., Стаханов М.Л., Юдина Н.В. , Горчак Ю.Ю.

Кафедра онкологии и лучевой терапии МГМСУ,
Онкологический центр ОАО РЖД, Москва

Введение. Подавляющее число больных раком простаты на момент первичной диагностики находятся в пожилом или старческом возрасте. В связи с этим их состояние, как правило, отягощено множеством сопутствующих заболеваний, весьма осложняющих выбор и проведение рационального и адекватного лечения. На этом фоне перспективным представляется метод биоэлектротерапии.

Цель исследования: Оценить эффективность биоэлектротерапии больных раком простаты.

Материалы и методы. За период с 2005 по 2011 гг. на кафедре онкологии и лучевой терапии МГМСУ, на базе онкоурологического отделения Онкологического центра ОАО РЖД биоэлектротерапия выполнена 57 пациентам в возрасте от 55 до 86 лет по поводу рака простаты. Традиционное радикальное лечение этим больным в силу различных объективных причин было не показано. У всех 57 пациентов опухоль соответствовала T3a-b N0 M0; показатели ПСА 10-20 нг/мл, IPSS 8-9 баллов, максимальная скорость истечения мочи 5,4-7,2 мл/сек. Однако никто из них не нуждался в выполнении предварительной цистостомии.

Лечение проводили на аппарата ВЕТ-7 (производство Германии). Курс биоэлектротерапии состоял из 5-12 сеансов лечения. Интервалы между сеансами составляли от 2 до 6 недель, их длительность у каждого больного определяли индивидуально.

Результаты. После первого сеанса все 57 больных отметили улучшение т. н. «качества жизни», что в первую очередь выражалось в увеличении интервалов между актами мочеиспускания и существенного усилении напора струи. По данным лабораторно-инструментального обследования этих больных отмечено снижение показателей ПСА, уменьшение опухолевого узла и снижение интенсивности его кровоснабжения, а также увеличение максимальной скорости истечения мочи и значительное уменьшение остаточного объема мочи.

Из 19 больных, пролеченных 5 лет назад, 2 умерли. Из них один от рака желудка, а другой – при явлениях генерализации рака простаты на 6-ом году после окончания биоэлектротерапии. Выпали из наблюдения по неизвестным причинам 7 из 19 больных этой группы. За остальными 10 пациентами до настоящего времени осуществляется дальнейшее динамическое наблюдение. Признаков опухолевого поражения простаты у них нет.

Из 38 больных, которым биоэлектротерапия проведена менее чем 5 лет спустя, признаков продолжения и генерализации заболевания не установлено. При этом у 21 пациента зафиксирована регрессия болезни в виде уменьшения опухоли и снижения ее васкуляризации, а в 17 наблюдениях, после проведения одного – трех сеансов биоэлектротерапии отмечена четкая стабилизация размеров опухоли на фоне умеренного снижения показателей ПСА.

Выводы. Биоэлектротерапия показала определенную эффективность лечения больных раком простаты, а при отсутствии осложнений и с учетом простоты выполнения сеанса вполне может быть признана одним из альтернативных методов лечения этой категории больных.

Метод атомно-силовой микроскопии в диагностике опухолей молочной и щитовидной железы

Волченко Н.Н., Решетов И.В., Славнова Е.Н., Сухарев С.С.

Московоский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена, Москва, Россия

Цель исследования: Разработка и усовершенствование метода цитологической диагностики опухолей и предопухолевых заболеваний молочной, щитовидной железы путем применения атомно-силовой микроскопии.

Материалы и методы: В работе использовался исследовательский Атомно Силовой Микроскоп (АСМ) производства «ЗАО НТ НДТ» г.Зеленоград, Россия.

Исследовали 120 цитологических препаратов опухолей молочной и щитовидной желез, полученные методом тонкоигольной аспирационной биопсии под контролем ультразвукового исследования и соскобы с операционного материала. Исследовали 15 иммуноцитохимических препаратов рака молочной железы. Иммуноцитохимию проводили методом Ultra Vision для определения экспрессии онкобелка Her2/neu (с-erbB-2) при раке молочной железы. Все препараты исследовались с помощью обычной световой микроскопии, а затем с помощью АСМ.

Результаты: С помощью АСМ решены три задачи цитологической диагностики:

1. Разработаны объективные критерии дифференциальной диагностики между нормальными клетками и клетками рака молочной железы (РМЖ), папиллярного рака щитовидной железы (ПР ЩЖ). Подобраны объективные морфометрические показатели, имеющие дифференциально-диагностическое значение.

Молочная железа.
При проведении АСМ в клетках инвазивного протокового РМЖ отмечался грубый микрорельеф поверхности ядер, ядрышки хорошо просматриваются в виде локальных возвышений над поверхностью ядра, ядерно-цитоплазменное соотношение сдвинуто в сторону ядра. Контуры ядра и цитоплазмы неровными. Высота ядра составляет – 574±143 нм. Высота цитоплазмы – 248±94 нм, соотношение высоты ядра к высоте цитоплазмы составляет 2.5±1. Высота ядрышек над поверхностью ядра – 156±90 нм.

Методом АСМ при фиброаденоме (ФА) в клетках эпителия хорошо определялась сглаженность микрорельефа ядер. Контуры ядра и цитоплазмы были ровными. Если провести сечение клеток плоскостью, параллельной вертикальной оси, определяются высота ядра – 417±89 нм и цитоплазмы – 239±57нм. Соотношение высот ядра и цитоплазмы 1.8±0.4. Этот параметр может служить объективным критерием дифференциальной диагностики ФА и РМЖ (при раке – 2.5±1, при ФА – 1.8±0.4, p<0.05).

Щитовидная железа.
При исследовании ПР ЩЖ методом АСМ обращает на себя внимание грубый микрорельеф поверхности ядер. Обнаруживаются ядрышки в виде локальных возвышений. Одним из важных диагностических признаков является обнаружение внутриядерных включений цитоплазмы (инвагинаций цитоплазмы), глубина которых 290±82 нм. Следует отметить небольшое увеличение размеров ядер при ПР ЩЖ, высота цитоплазмы – 266±74 нм, высота ядра – 605±103 нм, высота ядрышек (над ядром) – 353+216 нм. Соотношение высоты ядра к высоте цитоплазмы – 2.5±1.2. Отношение высоты ядрышка над ядром к высоте ядра – 0.34±0.21.

Измерения морфометрических параметров с помощью АСМ при фолликулярной аденоме щитовидной железы показали, что высота цитоплазмы 277±64 нм, высота ядра – 547±151 нм. Соотношение высоты ядра к высоте цитоплазмы – 2±0.5. Отношение высоты ядрышка над ядром к высоте ядра – 0.63±0.43. Значения отношения высоты ядрышка к высоте ядра отличаются при ПР ЩЖ и фолликулярной аденоме и могут служить объективными критериями дифференциальной диагностики между этими патологическими процессами (для ПР ЩЖ – 0.63±0.43, для фолликулярной аденомы 0.34+0.21, p<0.05).

На сканах коллоидного зоба, полученных средствами АСМ, видны клетки правильной округлой формы, со сглаженным микрорельефом ядер, отсутствием ядрышек, небольшой цитоплазмой. Высота ядра – 315±82 нм, высота цитоплазмы – 169±42 нм. Соотношение высоты ядра к высоте цитоплазмы 1.9±0.6. Наши измерения показали, что клетки коллоидного зоба ЩЖ и ПР ЩЖ различаются статистически значимо (p<0.05) по следующим параметрам: высота цитоплазмы, высота ядра, соотношение высот ядра и цитоплазмы (для коллоидного зоба 1.9±0.6, для ПР ЩЖ – 2.5±1.2).

2. Разработаны объективные критерии различных степеней дифференцировки инвазивного протокового рака молочной железы.

Важным показателем степени дифференцировки рака молочной железы служит структура и размеры ядрышек. В наших исследованиях наблюдались 3 вида ядрышек: при высокодифференцированном раке преобладали ядрышки цилиндрической формы диаметром в среднем 0,6 мкм с толщиной стенок около 200 нм и высотой над ядром порядка 20 нм, при умеренно-дифференцированном – цилиндрические с диаметром около 3 мкм, толщиной стенок порядка 1 мкм и высотой над ядром порядка 50 нм, при низкодифференцированном – в виде сплошного (нецилиндрического) возвышения диаметром 2 мкм и высотой над ядром около 150 нм.

Таким образом, были получены объективные дифференциально-диагностические критерии между различными степенями дифференцировки рака МЖ по форме и размеру ядрышек.

3. Определены объективные критерии иммуноцитохимической реакции (ИЦХ) гиперхэкспрессии онкопротеина HER2/neu при раке молочной железы. АСМ иммуноцитохимических препаратов с гиперэкспрессией Неr2/neu позволяет четко идентифицировать увеличение и уплотнение мембраны опухолевых клеток. При АСМ гиперэкспрессия Неr2/neu проявляется возвышением мембраны клеток на 850 нм. Методом АСМ возможна оценка интенсивности иммуноцитохимической реакции по высоте окрашенной мембраны, которая меняется от практически нулевой до 850 нм в зависимости от степени экспрессии онкопротеина Неr2/neu.

Легко оценивать и замкнутость окраски мембраны. Важность определения при раке молочной железы гиперэкспрессии рецептора эидермального фактора роста 2-го типа Неr2/neu, придающего клеткам свойство неограниченного деления, определяется тем, что эти опухоли с одной стороны имеют плохой прогноз, но в то же время хорошо поддаются таргетной терапии герцептином.

Биокерамические материалы в системе гидроксиапатит-карбонат кальция для инженерии костной ткани

Гольдберг М.А.¹, Смирнов В.В.¹, Баринов С.М.¹, Сергеева Н.С.², Свиридова И.К.², Кирсанова В.А.², Ахматова С.А.²

¹ Учреждение Российской академии наук Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова РАН,
² ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена, Москва, Россия

В настоящее время в качестве материалов для костной инженерии наиболее часто применяю гидроксиапатит и материалы на его основе с анионными и катионными замещениями. Еще одним активно развивающимся направлением в биоматериаловедении являются материалы на основе карбоната кальция, в частности природные кораллы ряда семейств (Acroporidae, Porites, Gonioporidae и др.).

В настоящей работе рассмотрены композиционные материалы на основе двух вышеуказанных компонентов – гидроксиапатита и карбоната кальция. Основным преимуществом данных материалов является контролируемая скорость биорезорбции, позволяющая подбирать оптимальный материал в зависимости от размера костного дефекта и возраста пациента, в зависимости от соотношения компонентов. При этом химическим методом осаждения из водных растворов можно получить смешение основных компонентов на наноуровне, что препятствует избирательной резорбции более растворимого компонента – карбоната кальция.

Согласно данным рентгенофазового анализа, синтезируемые материалы являлись бифазными, содержащими карбонат – замещенный гидроксиапаптит и карбонат кальция. Разработанная технология спекания позволяла получить прочную биокерамику без термического разложения карбонат – содержащих фаз, способного привести к формированию токсичного оксида кальция. Проведенные испытания in vitro показали, что все исследуемые образцы были не токсичны для клеток, поддерживали адгезию, распластывание и пролиферацию фибробластов человека. По данным подкожных испытаний in vivo, материалы являлись биосовместимыми, поддерживали неоваскуляризацию и образование соединительной ткани.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ №11-08-00596а.

Разработка гликоконъюгатов на основе природных хлорофиллов в качестве ИК-фотосенсибилизаторов для ФДТ рака

Грин М.А.¹, Миронов А.Ф.¹, Плотникова Е.А.², Якубовская Р.И.²

¹ Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова,
² ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена» Минздравсоцразвития России, Москва, Россия

В настоящее время применяются в клинике или находятся на разных стадиях клинических испытаний фотосенсибилизаторы (ФС) различных классов. Среди них особый интерес представляют природные хлорофиллы и их производные с интенсивным поглощением в красной и ближней ИК-области спектра, поскольку их терапевтическое окно поглощения (660-800 нм) открывает новые возможности для диагностики и лечения злокачественных новообразований.

Однако сами хлорины и бактериохлорины имеют ограниченное применение в качестве ФС из-за высокой гидрофобности, низкой химической и фотостабильности, умеренной селективности накопления в раковых клетках. Туморотропность ныне используемых ФС невелика и реализует лишь 2–3-х кратное повышение концентрации пигмента в опухолевой ткани по сравнению со здоровой. Это приводит к побочным эффектам фотодинамической терапии, включающим фотоповреждение здоровых тканей, окружающих опухоль.

Одним из возможных путей решения этой задачи является конъюгация молекулы ФС с лигандами, для которых имеются специфические рецепторы на поверхности опухолевых клеток.

Показано, что углеводные заместители не только увеличивают растворимость хлоринов в воде, но и обеспечивают векторную доставку ФС внутрь клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза.

В настоящей работе предложены методы синтеза конъюгатов природных хлоринов с углеводами, базирующиеся на современных реакциях органической химии. Получены модификационные ряды гликозилированных хлоринов и бактериохлоринов, содержащих остатки лактозы и галактозы в различных положениях макроцикла.

Сравнительное исследование, выполненное на различных культурах клеток опухолей человека, показало, что положение углеводных заместителей в макроцикле, их количество, а также тип сахара значительным образом влияют на активность ФС и их накопление в клетках. Наиболее высокая фотоиндуцированная активность выявлена у гликоконъюгатов с остатком углевода в пиррольном кольце А. Увеличение количества углеводных фрагментов, а также присоединение их по «нижней» части макроцикла значительно снижает фотоактивность красителей.

Биоконъюгированные антистоксовые нанолюминофоры: перспективы применения в онкологии

Гуллер А.Е.¹, Шехтер А.Б.¹, Нечаев А.В.², Деев С.М.³, Ивукина Е.А.³, Генералова А.Н.³, Соковиков В.В.⁴, Звягин А.В.⁴,⁵

¹ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова;
² МИТХТ им. М.В. Ломоносова,
³ ИБХ им. им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
⁴ ООО «Митрель-Люмитек»; Москва, Россия
⁵ Macquarie University, Sydney, Australia

Новая технология выявления, дифференциальной диагностики и прецизионного определения границ опухолевых образований, основана на введении в организм уникального контрастирующего агента, представляющего собой сложный молекулярный комплекс, состоящий из особых светящихся наночастиц, и биомолекул, специфически связывающихся с целевым антигеном. Такие наночастицы называются антистоксовыми люминофорами или наноразмерными фосфóрами (НАФ), а молекулярные комплексы, получаемые путем их конъюгации с биомолекулами, – БиоНАФ.

БиоНАФ избирательно накапливаются в патологически измененных тканях благодаря двум механизмам – пассивному и активному. Пассивный механизм связан с усиленной васкуляризацией и повышенной сосудистой проницаемостью в таких зонах (т.н. феномен EPR). Активный механизм основан на связывании антигена опухолевой ткани с антителом, входящим в состав БиоНАФ. Антитела для БиоНАФ подбираются в соответствии с целевыми антигенами и присоединяются к НАФ.

Благодаря своему составу и структуре, на облучение инфракрасным светом НАФ отвечают яркой люминесценцией в видимом и инфракрасном диапазонах электромагнитных волн. Свечение в видимом диапазоне можно наблюдать непосредственно, невооруженным глазом (поверхностная визуализация), а с помощью портативного томографа можно вызывать и регистрировать свечение наночастиц в глубине биологических тканей (до 1 см) (оптическое зондирование).

В эксперименте показано, что с помощью технологии БиоНАФ можно выявлять пораженные участки тканей диаметром менее 5 мм. (иссекать, вводить фармпрепараты, подвергать лучевому лечению). Технология может применяться при полостных хирургических операциях, при лапароскопии и эндоскопии, а также при внешнем осмотре пациента (например, при диагностике опухолей кожи). В отличие от флуоресцентных красителей, радиофармпрепаратов и квантовых точек, БиоНАФ не токсичны и не радиоактивны, быстро выводятся из организма.

Определение структуры и механических свойств цитоскелета раковых и нормальных клеток

Ефремов Ю.М., Докрунова А.А., Багров Д.В., Воронцова О.В., Соколова О.С.

МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва, Россия

Строение и регуляция актинового цитоскелета в раковых и нормальных клетках сильно отличаются, что, возможно, связано с изменениями в активности актин-связывающих белков (Jordan and Wilson, 1998). В результате, раковые клетки более деформируемы, чем нормальные, и примерно на 70% мягче (Cross et al, 2007). Предположительно, особые механические свойства раковых клеток играют важную роль в метастатических процессах и могут быть использованы как маркер метастатического потенциала (Guck et al, 2005). В процессе инвазии происходит адгезия раковой клетки к базальной мембране, локальный протеолиз внеклеточного матрикса и дальнейшая миграция клетки в ткань, для чего требуется активное изменение структуры цитоскелета (Friedl and Wolf, 2003).

Мы исследовали эффект инактивации одного из факторов нуклеации актина – формина – на модуль Юнга раковых и нормальных клеток. В качестве раковых были использованы эпителиальные клетки рака простаты DU-145 и PC3, в качестве нормальных – клетки Vero из эпителия почки африканской зеленой мартышки. Для измерения модуля Юнга использовали метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) с кантилеверами, модифицированными микросферами. Это позволяло лучше контролировать геометрию зонда и получать значения модуля Юнга, усредненные по относительно большой контактной площадке.

Измеренный нами модуль Юнга клеток Vero составляет ~2 кПа, что хорошо соответствует данным предыдущих исследований нераковых клеток (Faria et al, 2008). У раковых клеток DU-145 и PC3 модуль Юнга значительно меньше (на 40-42%). После инкубации клеток Vero с 2 мкМ раствором ингибитора формина SMIFH2 в течение 14 часов, их модуль Юнга уменьшился на ~30%. С помощью конфокальной микроскопии (окраска родамин-фаллоидином) было выявлено, что в клетках, подвергшихся воздействию SMIFH2, число актиновых филаментов уменьшилось и они, в основном, расположены у основания клетки.

У этих клеток также наблюдалось увеличение числа мелких филоподий. Ранее было показано, что экспрессия формина в тканях рака простаты повышена по сравнению с нормальными клетками (Sokolova et al, 2011). Принимая во внимание тот факт, что уменьшение количества фибриллярного актина часто наблюдается в раковых клетках, мы предполагаем, что формин в клетках рака простаты может быть инактивирован. Инактивация нуклеаторов актина, по-видимому, ведет к изменению эластических свойств раковых клеток.

1. 1. MA Jordan, L Wilson. Microtubules and actin filaments: dynamic targets for cancer chemotherapy Current Opinion in Cell Biology 10(1), 123-130 (1998).
2. SE Cross, YS Jin, J Rao, JK Gimzewski Nanomechanical analysis of cells from cancer patients Nature Nanotechnology 2, 780-783 (2007).
3. J Guck, S Schinkinger, B Lincoln, F Wottawah S Ebert, M Romeyke, D Lenz, HM Erickson, R Ananthakrishnan, D Mitchell, J Käs, S Ulvick, C Bilby. Optical Deformability as an Inherent Cell Marker for Testing Malignant Transformation and Metastatic Competence Biophysical Journal 88(5), 3689-3698 (2005).
4. P Friedl, K Wolf. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms Nature Reviews Cancer 3, 362-374 (2003).
5. EC Faria, N Ma, E Gazi, P Gardner, M Brown, NW Clarke, R D. Snook. Measurement of elastic properties of prostate cancer cells using AFM Analyst 133, 1498-1500 (2008).

Перспективы молекулярно-генетического мониторинга колоректального рака и некоторых других видов злокачественных новообразований человека

Зарецкий А.Р.^1,2*, Белоусова А.В.², Дрозд О.В.², Шагин Д.А.^1,2

¹ ИБХ им. акад. М. М, Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН,
² ООО «Евроген Лаб», Москва, Россия

Введение. Фрагменты ДНК опухолевого происхождения могут быть обнаружены в различных биологических образцах онкологических больных, включая плазму крови, мочу, слюну и даже конденсат выдыхаемого воздуха. Качественный и количественный анализ опухолеспецифических ДНК может стать основой для минимально инвазивного скрининга злокачественных опухолей, оценки радикальности проведенного лечения, а также для мониторинга динамики опухолевого процесса и изменения профиля лекарственной чувствительности опухолевых клеток в ходе терапии. Однако мутантные и гиперметилированные фрагменты ДНК опухолевого происхождения представлены в этих образцах, во-первых, в предельно малом количестве, а во-вторых, на фоне многократно большего количества фрагментов ДНК «дикого типа», попадающих туда из неизмененных органов. Соответственно, основой для неинвазивной генодиагностики рака могут стать только методы с высокой чувствительностью и избирательностью.

Цель. Разработать стратегию создания тест-систем для неинвазивной генодиагностики в онкологии.

Материалы и методы. Были систематизированы данные научной литературы об имеющихся технологиях мутационно-специфического анализа и уровне их чувствительности, специфичности и воспроизводимости. На основе систематизированных данных выбирались наиболее перспективные технологии, в которые далее вносились необходимые модификации и дополнения. Тестирование вариантов технологии осуществлялось с помощью ПЦР в режиме реального времени, результаты которой проверялись анализом кривой плавления, электрофорезом в ПААГ и секвенированием продуктов ПЦР. Использовались панели валидированных контрольных образцов ДНК.

Результаты. По результатам анализа литературных данных наиболее перспективными методами были признаны т. н. «proof-reading PCR» и «wild-type blocking PCR». Применимыми для неинвазивной генодиагностики рака могут быть методы с избирательностью ≥ 1 : 100; однако для осуществления таких задач, как скрининг, необходима избирательность порядка 1 : 100 000. Разработанные нами тест-системы для анализа мутаций в генах K-Ras и B-Raf , использующие метод «wild-type blocking PCR», обеспечивают избирательность порядка 1 : 200 при использовании ПЦР в режиме реального времени и порядка 1 : 2 000 при использовании ПЦР с последующим прямым секвенированием продуктов ПЦР по Сэнгеру. Чувствительность данных методик в обоих случаях составляет около 10 копий в реакции. Методики отличаются также хорошей воспроизводимостью на ДНК из различных биологических образцов.

Заключение и выводы. Разработанные нами тест-системы позволяют решать некоторые задачи ненинвазивной генодиагностики в онкологии. Для получения более универсальных тест-систем необходимо значительное увеличение избирательности анализа. Вопреки мнению ряда авторов, мы полагаем, что добиться такого увеличения путем модификации условий реакции почти невозможно. В докладе будут описаны подходы к практически неограниченному увеличению избирательности мутационного анализа с применением высокопроизводительных генетических анализаторов, а также будут сформулированы требования к биологическому материалу для такого высокоизбирательного анализа и методологические предосторожности, необходимые при интерпретации его результатов.

Изучение действия углеродных нанотрубок на рост перевиваемой опухоли

Златник Е.Ю.¹, Передреева Л.В.¹, Мурадян В.Е.², Садков А.Н.³, Квачева Л.Д.⁴, Червонобродов С.П.³

¹ ФГУ «РНИОИ Минздравсоцразвития России», Ростов-на-Дону,
² Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка,
³ ООО «Карбонлайт», Долгопрудный Московской области,
⁴ Институт элементоорганических соединений РАН, Москва, Россия

Исследование действия различных наноразмерных частиц на опухолевый рост является актуальной задачей современной биологии и медицины. Мы изучали влияние на него одностенных углеродных нанотрубок (НТ), функционализированных NH2-группами (длина 40-100 нм, диаметр 10-30 нм), изготовленных на предприятии «Карбонлайт» (Москва).

Цель работы: экспериментальная оценка влияния введения НТ на опухолевый рост.

Материалы и методы. Эксперимент проводили на 10 белых беспородных крысах-самцах (масса 170-200 г). Опухоль лимфосаркому Плисса (ЛСА) перевивали под кожу спины по 15х106 клеток/мл. Когда объем опухоли достиг 0,1 см3, животным опытной группы начинали интратуморальное введение взвеси НТ (100 мкг/мл в 4% проксаноле, перед введением обрабатывали ультразвуком для предотвращения агрегации); выполняли 8 введений, суммарная доза НТ 400 мкг на крысу. Контрольной группе аналогично вводили 4% проксанол. Определяли динамику объема опухоли и продолжительность жизни животных.

Результаты. Через 1 неделю после начала введения исследуемых веществ в контрольной группе объем опухоли достиг 19,92±1,4, а в опытной группе – 3,26±0,63 см3; через 2 недели объем ЛСА составлял 52,4±7,33 и 7,88±1,22 см3 соответственно (в оба срока исследования различия статистически достоверны, Р<0,05). К 3-й неделе все контрольные животные погибли при явлениях бурного роста опухоли, у опытных она выросла до 14,17±1,01 см3, т.е. была меньше, чем сформировавшаяся в контрольной группе через 1 неделю. Тем не менее, в опытной группе рост ЛСА продолжался, животные погибли. При этом их продолжительность их жизни составила 32,4±1,54 дня после перевивки или 25,1±2,2 дней после начала введения НТ, статистически достоверно превышая контроль, где этот показатель составлял 24±1,2 дня после перевивки или 17,0±1,8 дней после начала введения проксанола (Р<0,05).

Таким образом, интратуморальное введение взвеси коротких одностенных углеродных нанотрубок, функционализированных аминогруппами, приводит к торможению роста перевиваемой ЛСА Плисса, но в исследованной дозе не вызывает ее регрессии.

Гиперполяризующее действие одностенных углеродных нанотрубок на клетки опухолевого асцита саркомы 37 мышей in vitro

Златник Е.Ю., Тарнопольская О.В., Передреева Л.В.

ФГБУ «РНИОИ Минздравсоцразвития России», Ростов-на-Дону, Россия

Изучение биологических свойств опухолевых клеток, включая их мембранные характеристики при различных внешних воздействиях, является актуальной научной задачей. Мембранология и мембранные технологии являются важным разделом нанотехнологий. Нами изучено влияние углеродных нанотрубок (НТ) на мембранный потенциал (МП) клеток в культуре для оценки их эффекта на эту интегральную характеристику состояния мембран, связанную с регуляцией функции клеток.

Материалы и методы. Использовали одностенные углеродные нанотрубки (НТ), функционализированные NH2- и СООН-группами, изготовленные на предприятии «Карбонлайт» (Москва), длина 40-100 нм, диаметр 10-30 нм в концентрации 1 мкг/мл. Взвесь НТ инкубировали со взвесью клеток асцитной саркомы 37 мышей в течение 30-180 мин при 37°С. Исследование МП проводили с помощью пары потенциалозависимых флуорес-центных зондов: аниона АНС (1-анилинонафталин-8-сульфонат) (Serva) и катиона ДСМ (n-толуолсульфонат 4-(n-диметиламиностирил)-1 метилпиридиний) (синтезирован НИИФОХ при ЮФУ). Флуоресценцию АНС возбуждали светом длиной волны 375 nm, длина волны флуоресценции АНС была 480 nm; для ДСМ 450 nm и 520 nm соответственно. Конечная концентрация АНС в препарате клеточной суспензии была 40 мкМ, ДСМ – 20 мкМ. Готовили препараты на предметных стеклах, съемку и измерения проводили на люминесцентном микроскопе «Axio Imager M2» Zeiss с помощью программного обеспечения AxioVision, rel.4.8. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistika 6.0, использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.

Результаты показали повышение МП клеток (гиперполяризацию) через 1 час инкубации с НТ в 1,25-1,5 раз по сравнению с контролем. Через 3 часа инкубации клетки необратимо меняются: их объем увеличивается в 1,3-1,7 раза, происходит их деструкция, дистрофия ядер. Предположительно, это говорит о том, что при повреждении клеток С37 под действием НТ перфорации мембраны не происходит, т.к. в противном случае внеклеточная и внутриклеточная концентрация К+ выравнивается, что вызвало бы деполяризацию. Возможно, в клетках саркомы включаются механизмы поддержания ионного гомеостаза, например Na-K-АТФаза, на что косвенно указывает высокая яркость митохондрий при окраске ДСМ, характеризующая их активность.

Применение препарата «Эльвита-удивит» в онкологии

Ихалайнен Е.С., Ершова М.Л., Кондаков С.Э., Мельников М.Я.

Химический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова,
НОЦ Химическая физика биохимических и биологических процессов, ООО «Алвита», Москва, Россия

Анализ литературы по онкогенезу позволил выделить следующие, считающиеся доказанными, общие черты течения любого опухолевого процесса. Наличие нескольких стадий развития, устранение дифференциации опухолевых клеток по сравнению с исходными, упрощение метаболизма опухолевых клеток (уменьшение количества ферментных систем, гликолизный метаболизм), увеличение скорости деления клеток до нескольких порядков по сравнению с нормальными [1].

Исходя из предложенного Н.М.Эмануэлем кинетического подхода [2], нами были выделены вещества, которые образуются только при нарушении обычных путей метаболизма глюкозы в клетоках. Применение данных веществ, класса оксалей, в виде конъюгатов с углеводородами в нано концентрациях позволило создать малотоксичный препарат, обладающий иммуномодулирующей активностью, что в ряде случаев позволяет восстановить метаболизм опухолевых клеток [3].

На основе данного класса веществ был разработан фармацевтический препарат «Эльвита-Удивит», аттестованный и выпускающийся в настоящее время для ветеринарии. Проведенные испытания показывают совместимость данного препарата с любой из медикаментозных терапий, применяемых в онкологии, уменьшение сроков ремиссии после операций по удалению опухолей, снижение интоксикации при проведении курса химиотерапии и облучения у домашних животных и в ряде случаев консервацию процессов метастазирования и опухолевого роста.

1. W. Oehlert. The kinetic mechanism of cell resistant. Cell Tissue Kinet. 1973; 6: 325-335.
2. N.M.Emanuel', and Biological Kinetics. Russ. Chem. Rev. 1981; 50 (10): 901–947.
3. И.Н. Швембергер. Нормализация опухолевых клеток. Л.: Наука. 1987; 141.

Синтез in situ композиционных материалов фосфаты кальция/биополимер

Комлев В.С., Федотов А.Ю., Баринов С.М., Фадеева И.В., Бакунова Н.В.

Учреждение российской академии наук Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова РАН, Москва, Россия

Композиционные материалы на основе биодеградируемых полимеров, армированных фосфатами кальция, перспективны для применения в качестве матриксов для восстановления поврежденных костных тканей. В работе изложены результаты исследований в области синтеза композиционных материалов с биополимерной матрицей, армированной частицами фосфата кальция.

Синтез фосфатов проводился непосредственно в растворах биополимера (хитозан, желатин), при различных рН раствора. Получены пористые композиционные материалы с варьируемыми микроструктурой, составом и размером частиц фосфата кальция. Материалы перспективны для использования в реконструктивно- восстановительной хирургии в онкологии.

Работа поддержана грантом РФФИ ОФИ № 11-03-12083
«Упрочнение пористых оксидных материалов модифицированием поверхностей пор полимерами»

Повреждающее действие комплекса наноалмазов и салиномицина в модели раковых стволовых клеток ин виво

Конопляников А.Г., Коноплянников М.А.

Федеральное государственное бюджетное учреждение Медицинский радиологический научный центр (ФГБУ МРНЦ) Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Обнинск
Российский государственный медицинский университет (РГМУ) им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия

На модели раковых стволовых клеток (РСК), полученных путем обработки лабораторных мышей канцерогеном 1,2-диметилгидразином, было показано, что комплекс наноалмазов и ингибитора раковых стволовых клеток салиномицина по своей эффективности против РСК значительно превышает повреждающее действие каждого из использованных компонентов отдельно в этой модели и без повышения токсического действия на организм животных.

Это позволяет надеяться, что наноалмазы могут применяться не только в комбинации с известными химиотерапевтическими препаратами, что сейчас эффективно изучается во многих зарубежных научно-исследовательских учреждениях, но и могут с успехом применяться в качестве агента доставки специфических противоопухолевых ингибиторов к зонам РСК, что делает перспективным этот новый способ усиления эффекта химиотерапии резистентных форм злокачественных новообразований.

Опыт применения эрлотиниба в терапии местно-распространенного плоскоклеточного рака орофарингеальной области

Космынин А.А.*, Коробкова А.Ю., Генс Г.П.

Московский Государственный Медико-Стоматологический Университет,
Онкологический центр ОАО «РЖД», Москва, Россия
* E-mail:

Эффективное лечение местно-распространенного плоскоклеточного рака орофарингеальной зоны остается актуальной проблемой и по настоящее время. Ввиду того, что в 80-100% при плоскоклеточном раке орофарингеальной области выявляется гиперэкспрессия рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), наиболее перспективным направлением в лечении видится применение таргетной терапии. Эрлотиниб (Тарцева) – препарат молекулярно нацеленного действия, высокоспецифично блокирующий тирозинкиназу рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), играющего важнейшую роль в развитии опухоли, её росте, ангиогенезе и метастазировании.

В ряде клинических исследваний показана достоверная эффективность эрлотиниба. Так во II фазе применения эрлотиниба у больных метастатическим ПРГШ после хирургического лечения, химиотерапии и/или лучевой терапии медиана времени до прогрессирования составила 9,6 недель (95% ДИ 8,1-12,1 недель), медиана общей выживаемости 6 месяцев, что составило 10,4% (95% ДИ 5,5-17,5%).

Задача исследования. Оценить эффективность и переносимость комбинации цисплатин/5-фторурацил с эрлотинибом у ранее нелеченных больных распространенным плоскоклеточным раком орофарингеальной зоны с учетом биологического профиля EGFR.

Материал и методы. Лечение получали больные с морфологически верифицированным диагнозом плоскоклеточного рака полости рта, глотки III,IVстадии, которым проводилась индукционная терапия по следующей схеме: цисплатин в дозе 100 мг/м2 в 1 день, 5-фторурацил в дозе 500 мг/м2 в/в 1-5 день с интервалом в 21 день 4 курса и эрлотиниб 100 мг per os с первого дня лечения ежедневно. Объектиный ответ оценивался согласно критериям RECIST. До начала терапии у всех больных определялся молекулярный статус EGFR методом иммуногистохимии и способом полимеразно-цепной реакции. Переносимость и качество жизни оценивались по субъективному состоянию (ECOG), критериям токсичности СTC-NCIC.

Результаты. С октября 2010 по ноябрь 2011 года лечение было проведено 12-ти больным, которые получали лечение стандартной химиотерапией в комбинации с ежедневным приемом эрлотиниба. Эффект оценен у всех больных завершивших 1-й этап комплексного лечения. Объективный противоопухолевый эффект наблюдался у 10 больных (83,3%) – частичный ответ (регрессия опухоли на 50-80%), у двоих пациентов (16,7%) достигнута стабилизация процесса.

В 100% случаев отмечена гиперэкспрессия EGFR, мутаций не обнаружено. Переносимость лечения удовлетворительная –ECOG 1-2 до после завершения терапии. Из побочных реакций обращала на себя гематологическая токсичность 1-2 степени, кожная сыпь 1-2 степени в 90% случаев, что коррелировало с клиническим ответом опухоли.

Выводы. Изученная комбинация обладает выраженной противоопухолевой активностью и умеренной токсичностью, хорошей переносимостью. Отсутствие мутации EGFR не влияет на эффективность терапии. Набор материала продолжается.

Стабильные золи сульфида рения для радиоизотопной диагностики

Костылев А.И.¹, Покровский Ю.Г.¹, Фирсин Н.Г.¹, Решетов И.В.², Сухарев С.С.³

¹ ФГУП НПО «Радиевый институт им. В.Г. Хлопина», Санкт-Петербург,
² ФГУ «Московский Научно–исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена»,
³ Кафедра онкологии ИПК ФМБА, Москва, Россия

В докладе представлены результаты работ по получению наночастиц гептасульфида рения. Коллоидные растворы наночастиц гептасульфида рения находят применение в медицинских целях – как для диагностики, так и для терапии онкологических заболеваний. В первом случае такие растворы метят 99mTc , во втором – вводят изотоп 188Re.

В исследования для получения ультрадисперсного гептасульфида рения был использован метод его химического осаждения из растворов перрената аммония с последующим отделением центрифугированием. Определены условия получения устойчивых золей сульфида рения с размерами наночастиц 80-120 нм. Полученные препараты исследованы методом атомной силовой микроскопии.

Изучены условия присоединения метки 99mTc к наночастицам сульфида рения и устойчивость материала в физиологических растворах.

Разработка нового фотосенсибилизатора на основе биосовместимых полимерных наночастиц, допированных порфиразином иттербия

Леканова Н.Ю.¹, Балалаева И.В.¹, Клапшина Л.Г.², Лермонтова С.А.^1,2, Сайфуллаева М.А.¹, Ширманова М.В.³

¹ Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
² Институт металлоорганической химии им. Г.А. Разуваева РАН
³ Нижегородская государственная медицинская академия

В настоящее время в мире ведется активный поиск новых фотосенсибилизаторов с целью повышения эффективности флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии. Целью данной работы является оценка флуоресцентных и функциональных свойств новых потенциальных фотосенсибилизаторов на основе биосовместимых полимерных наночастиц, допированых порфиразином иттербия.

В ходе работы синтезирована группа порфиразиновых комплексов иттербия с разными боковыми заместителями. Получены их стабильные биосовместимые формы, путем заключения комплексов в наноразмерную полимерную капсулу.

Показано, что наночастицы, допированные порфиразином иттербия, обладают высоким коэффициентом поглощения и сильной люминесценцией в области оптического «окна прозрачности» биотканей. Кроме того, зарегистрировано значительное усиление флуоресценции комплексов в сыворотке крови и растворе альбумина, что свидетельствует об их связывании с белками. Показана способность комплексов к генерации синглетного кислорода при облучении.

Выявлено, что исследуемые наночастицы быстро накапливаются в опухолевых клетках в культуре и концентрируются вокруг ядра, локализуясь, предположительно, в лизосомах. В экспериментах in vitro было продемонстрировано отсутствие «темновой» цитотоксичности наночастиц в пределах до 0,1мМ. Предварительные эксперименты по оценке фармакокинетики показали, что максимум накопления наночастиц в опухоли составляет 6-10 часов. Практически полное выведение наночастиц из организма наблюдалось через 24 ч после инъекции. Более длительное (свыше 6 суток) удержание наночастиц было отмечено в коже и опухоли.

В целом, биосовместимые полимерные наночастицы, допированные порфиразином иттербия по своим оптическим свойствам и особенностям взаимодействия с биологическими объектами представляют интерес в качестве потенциального фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии и/или флуоресцентного маркера.

Иттербиевые комплексы порфиринов для диагностики злокачественных новообразований

Миронов А.Ф.¹, Румянцева В.Д.¹, Иванов А.В.², Хлебцов Н.Г.³, Шилов И.П.⁴

¹ Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова,
² НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей им. Н.Н. Блохина РАМН,
³ Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, РАН, Саратов
⁴ Институт радиотехники и электроники РАН, Фрязино, Россия

Важным направлением в борьбе с раковыми заболеваниями является раннее диагностирование опухоли, основанное на изучении либо собственной люминесценции перерожденной ткани, либо приобретаемое ею в процессе обработки специальными красителями. К таким соединениям относятся нефототоксичные иттербиевые комплексы порфиринов, которые при облучении имеют крайне низкий квантовый выход синглетного кислорода, что не вызывает разрушение ткани в отличие от ФДТ рака.

Нами осуществлен синтез большой группы иттербиевых комплексов природных и cинтетических порфиринов и изучены их физико-химические и биологические свойства. Среди исследованных соединений наиболее эффективным фотосенсибилизатором для люминисцентной диагностики злокачественных новообразований оказался 2,4-диметоксигематопорфирин IX (Yb-ФС), который получают из гемина крови. Yb-ФС имеет низкую токсичность, хорошо накапливается в опухоли и интенсивно флуоресцирует в диапазоне 975-985 нм, где собственная люминисценция биотканей является минимальной.

В дальнейшем, для отказа от использования липосомальной формы при введении препарата, была приготовлена его хорошо растворимая в воде дикалиевая соль. Данные по кинетике накопления и выведения на мышах-самках свидетельствуют о преимущественном накоплении препарата в опухоли через 48 часов после его введения в организм животных. Селективность Yb-ФС достигала 16. Показано, что время жизни люминисценции в растворе составляет 8-10 мкс и его можно детектировать при концентрациях 10-11 М.

Получены композитные наночастицы, состоящие из золото-серебрянных наноклеток, покрытые мезопористой оболочкой из двуокиси кремния и функционализированные Yb-ФС (около 1500 молекул на частицу). Проведено сравнение биораспределения и люминисценции Yb-ФС и его конъюгата с наночастицами на мышах с привитой карциномой Эрлиха. Показано увеличение накопления в опухоли композитных наночастиц по сравнению Yb-ФС.

Некоторые подходы к усовершенствованию моделей опухолевых 3D и long-term клеточных культур при исследовании воздействия нанопрепаратов

Мурашко Д.А., Абрамов А.А., Вислобоков А.А., Сапожников А.М.

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина, Москва, Россия

Развивающиеся в последние годы технологии 3D клеточных культур, long-term культур и первичных культур опухолевых клеток являются перспективными in vitro моделями для исследования воздействия нанопрепаратов на опухолевые клетки и ткани. Подобные модели, в сравнении с обычными культурами клеток, более приближенны к реальным условиям in vivo. Так, 3D культуры состоят из большого количества плотно ассоциированных друг с другом клеток, что не только моделирует реальные условия проникновения препаратов в настоящую опухолевую ткань, но и повышает сопротивляемость клеток к токсическим воздействиям препаратов.

Long-Term и первичные опухолевые культуры, в отличие от обычных клеточных линий, имеют генотип более близкий к родительской опухоли, что оправдывает все сложности работы с такими моделями. Несмотря на обилие уже существующих в настоящее время технологий, приспособление данных клеточных моделей для исследования воздействия новых препаратов и нанолекарственных комплексов оставляет широкое поле для усовершенствований. В частности, одной из проблем при исследовании воздействия препаратов на модели первичной клеточной культуры является значительная морфологическая и генетическая гетерогенность опухолевых клеток и клонов.

В этом случае определение «тотального» генотипа, а именно выделение ДНК из всего препарата лишено всякого смысла из-за невозможности отделить ДНК опухолевой клетки от ДНК нормальных, окружающих её клеток, и разного профиля экспрессии генов в клетках различного происхождения. Здесь нам на помощь приходят стандартные методы, первоначально разработанные для решения задач репродуктивных и молекулярно-генетических технологий.

В частности, для выделения отдельных опухолевых клонов и клеточных ассоциатов из первичных опухолевых культур и тканей в настоящее время используются микроманипуляция, микродиссекция – в вариантах УФ и ИК лазерной или механической диссекции, а для определения генотипа – усовершенствованные методы генетической диагностики. ИК лазерная микродиссекция, с некоторыми усовершенствованиями, с успехом может использоваться для выделения живых клеток и фрагментов тканей для их последующего анализа или культивирования, а также для моделирования глубокого проникновения в ткань препаратов, наночастиц и нанокомплексов при проверке их действия в моделях первичных и 3D опухолевых культур.

Прогностическое значение экспрессии белков-регуляторов апоптоза при раке предстательной железы

Пучинская М.В.

Минский городской клинический онкологический диспансер, Минск, Республика Беларусь

Рак предстательной железы (РПЖ) является одной из наиболее распространенных опухолей у мужчин. Важное значение в его возникновении и прогрессировании играет нарушение процесса апоптоза. В связи с этим экспрессия ряда белков-регуляторов апоптоза, в частности, проапоптотического белка семейства Bcl-2 Bax и мутантной формы антиапоптотического белка р53, может влиять на прогноз у пациентов с РПЖ после различных видов лечения.

Цель работы: определить прогностическое значение регуляторов апоптоза Вах и р53 у пациентов после радикальной простатэктомии (РПЭ).

Материалы и методы: были изучены образцы ткани РПЖ, полученные от 104 пациентов при РПЭ. Иммуногистохимическая окраска препаратов проводилась с использованием антител к Вах и р53 и визуализирующей системы EnVision (DAKO). Результаты обработаны статистически (Statistica 6.0, StatSoft.Inc).

Результаты. Во всех образцах присутствовала аденокарцинома простаты, степень ее дифференцировки определялась по системе Глисона. При этом 57 (54,81%) образцов были умеренно дифференцированными (сумма Глисона 4 – 6 баллов), а 47 (45,19%) – низкодифференцированными (сумма Глисона 7 – 10 баллов). Экспрессия белков оценивалась полуколичественно: для Вах по доле иммунопозитивных клеток в образце и интенсивности их окрашивания с последующим суммированием полученных баллов, для р53 – только по доле клеток с позитивно окрашенными ядрами.

Следует отметить, что в низкодифференцированных опухолях чаще встречалось снижение экспрессии Вах ниже максимальной оценки (33,33% vs. 82,98%, соответственно) и наличие мутантного р53 (89,36% vs. 66,67%). Также снижение экспрессии Вах и наличие мутантного р53 достоверно повышало частоту наступления неблагоприятных исходов (биохимический рецидив, появление метастазов, смерть пациента) как в целом в группе исследованных пациентов, так и у пациентов с высоко- и низкодифференцированным РПЖ (метод Каплана-Майера, лог-ранговый тест p<0,01; p<0,05 для р53 у пациентов с низкодифференцированным раком).

Выводы.
1. У пациентов с низкодифференцированным РПЖ чаще встречается снижение экспрессии проапоптотического белка Вах и наличие в ткани опухоли мутантной формы антиапоптотического белка р53.
2. Снижение экспрессии Вах и наличие мутантного р53 статистически достоверно ухудшает прогноз у пациентов с РПЖ, независимо от степени дифференцированности опухоли.

Использование иммуногистохимического определения белка Ki-67 для определения пролиферативной активности в раке предстательной железы

Пучинская М.В.¹, Летковская Т.А.²

¹ Минский городской клинический онкологический диспансер,
² Белорусский государственный медицинский университет, Минск, Республика Беларусь

В настоящее время в мире растет заболеваемость раком предстательной железы (РПЖ). Одной из важных характеристик опухоли, наряду со степенью ее дифференцировки, является пролиферативная активность. Наиболее часто для определения в опухоли клеток, находящихся в разных фазах митотического цикла, применяется иммуногистохимическое определение экспрессии в раке белка Ki-67.

Цель работы: определить пролиферативную активность РПЖ на основании определения экспрессии в опухоли белка Ki-67.

Материалы и методы: мы изучили образцы РПЖ, полученные при радикальной простатэктомии от 104 пациентов. Экспрессия Ki-67 определялась иммуногистохимически с использованием мышиных антител (DAKO) в разведении 1:200. Визуализирующая система – EnVision (DAKO). Результаты обработаны статистически (Statistica 6.0, StatSoft.Inc).

Результаты. Для оценки пролиферативной активности РПЖ мы рассчитывали индекс пролиферативной активности (ИПА) как процентное отношение числа Ki-67-позитивных клеток в 4 – 9 случайных полях зрения (×400) к общему числу опухолевых клеток в них. При этом ИПА в изученных образцах составил от 1,46 до 67,88, среднее значение 10,50±9,11. Наиболее часто встречались образцы с ИПА от 4 до 7 (27,88%) и от 7 до 10 (24,04%).

Была установлена статистически достоверная прямая корреляционная связь средней силы между ИПА и суммой Глисона (тест Спирмена, r=0,593, p<0,01), что, видимо, является следствием повышения пролиферативной активности опухоли в процессе ее дедифференцировки. Также у пациентов с низкодифференцированным раком (сумма Глисона 7 – 10 баллов) ИПА опухоли был достоверно выше, чем в случае более высокодифференцированных опухолей (сумма Глисона 4 – 6 баллов) (7,77±3,54 vs. 13,8±9,1, тест Манна-Уитни, p<0,01).

Выводы.
1. ИПА в РПЖ может варьировать в широких пределах.
2. Отмечается достоверная прямая связь между пролиферативной активностью опухоли и степенью ее дифференцировки.
3. Иммуногистохимическое определение белка Ki-67 может считаться достаточно доступным методом определения пролиферативной активности РПЖ, что может в последующем использоваться для уточнения диагноза и выбора оптимальной тактики лечения данного заболевания.

Экспериментальное исследование полимерных и биологических материалов для биоинженерной реконструкции верхних дыхательных путей in vivo

Решетов И.В.¹, Васильев А.В.¹, Батухтина Е.В.², Киселева Е.С.¹, Ребрикова И.В.¹

¹ МНИОИ им. П.А.Герцена МЗ РФ,
² Институт Биологии Развития им. Н.К. Кольцова РАН,
³ Кафедра онкологии ГОУ ИПК ФМБА России**, Москва, Россия

Цель исследования: сформулировать требования к биологическим свойствам носителя для многокомпонентного клеточного трансплантата, используемого для реконструкции верхних дыхательных путей.

Материалы и методы. Проведено экспериментальное исследование на 40 лабораторных животных – кроликах. Предметом экспериментальных исследований было изучение механизмов взаимодействия биоматериалов с компонентами многокомпонентного клеточного трансплантата. Особый интерес представляла оценка поведения хондроцитов на подложках-носителях и «in vivo». В работе были использованы следующие полимерные и биологические носители: биодеградируемая пористая губка «ЭластоПОБ-3D» изготовленная на основе бактериального сополимера полиоксибутирата с валератом и полиэтиленгликолем; «Биоматрикс», являющийся декальцинированной кортикальной костью; гранулы гидроксиаппатита; полимер из солей молочной кислоты; аллогенная надкостница, аллогенная кость.

Предварительно производилось культивирование хондроцитов на поверхности подложки-носителя. Затем производилась имплантация клеточного трансплантата в сальник на 2 недели. Контрольную группу составляли животные с имплантированным клеточным эквивалентом (хондроциты в коллагеновом геле) в сальник. Через две недели животные выводились из эксперимента, производилась визуальная и морфологическая оценка трансплантата.

Результаты. Суммарно оценивая результаты имплантации хондроцитов на различных носителях в сальник, при гистологическом исследовании, во всех группах животных было выявлено наличие воспалительной инфильтрации с продуктами биодеградации подложки-носителя без наличия хрящевой ткани. В контрольной группе животных и у одного животного при имплантации на «Биоматрикс» выявлено сохранение аллогенных хондроцитов. Необходимо отметить, что при имплантации на «Биоматрикс» отмечалась выраженная воспалительная инфильтрация и наличие некробиотических масс вокруг трансплантата. Можно предположить, что наличие некробиотических масс в виде волокон является продуктом резорбции «биоматрикса». Кроме того, очаги гранулематозного воспаления имелись и в контрольной группе животных, связанных скорей всего с наличием шовного материала.

Выводы. Проведенные морфологические исследования показали, что наличие любой, даже незначительной воспалительной реакции организма на подложку-носитель является губительной для хондроцитов, препятствует формированию многослойной структуры-хряща и приводит к его лизису. Представленные результаты исследования позволили сформулировать основные свойства, которым должен отвечать носитель: не должен оказывать токсического, аллергического, воспалительного, канцерогенного действия; носитель должен иметь структуру благоприятную для адгезии стволовых клеток, но препятствовать прорастанию сосудов внутрь, по возможности иметь трехмерную структуру (необязательно); носитель должен обладать достаточной прочностью - каркас трахеи; длительный срок биодеградации – не менее 6-х месяцев; при биодеградации не должен фрагментироваться.

Реабилитация больных раком щитовидной железы

Решетов И.В., Филоненко Е.В., Голубцов А.К., Кирпа Е.А.

Московский научно-исследовательский институт онкологии им. П.А. Герцена, Москва

Вступление. Доля рака щитовидной железы в структуре онкологической заболеваемости мужского населения стран СНГ достигла 0,5-1%, женского – 1-4,6%.Основной метод лечения рака щитовидной железы – хирургический. Особое место среди осложнений хирургического лечения рака щитовидной железы по тяжести проявления и сложности профилактики занимает послеоперационный гипопаратиреоз, который развивается при удалении или повреждении паращитовидных желёз во время хирургического вмешательства на щитовидной железе. Снижение уровня паратгормона в сыворотке крови при этом приводит к нарушению кальций-фосфорного обмена, проведения нервного импульса, сокращения мышц и свертывания крови, прочности и структуры скелетной системы. Поэтому повреждение паращитовидных желёз во время операции на щитовидной железе может привести к тяжелым проявлениям гипопаратиреоза.

Цель работы. Применяемые в настоящее время методы интраоперационной визуализации и сохранения паращитовидных желёз недостаточно эффективные. Цель данной работа – разработать методику профилактики паратиреоидной недостаточности у больных раком щитовидной железы, не требующую сложных инструментов, не дающую осложнений, легко повторяемую и дающую хорошие, стабильные результаты.

Материал и методы. Нами применен метод интраоперационного сохранения паращитовидных желёз у 73 больных. Описание метода: необходимые инструменты: а) Препарат Аласенс (гидрохлорид 5-аминолевулиновой кислоты) из расчёта 30мг/кг. б) Источники оптического излучения фирмы «Карл Шторц» – Германия, с длиной волны в диапазоне от 385 до 460 нм.

До выполнения оперативного вмешательства (как первичного, так и реоперации) у пациентов исследуется уровень паратгормона и кальция. Далее в день операции за 2,5-3 часа до интубации перорально принимается препарат аласенс (из расчёта 30 мг/кг). Интраоперационно выполняется флюоресцентная навигация паращитовидных желёз. При обнаружении флюоресцирующих участков выполняется срочное цитологическое исследование (подтверждение того, что участок – ткань паращитовидной железы). Выполняется удаление препарата. При отсутствии онкологических противопоказаний выполняется выделение и транспозиция (при необходимости – аутотрансплантация) паращитовидных желёз.

Для оценки эффективности сохранения паращитовидных желёз выполняется контроль уровня паратгормонана 7, 27 и 57 сутки после операции и кальция на 1, 3,7 сутки после операции и далее каждые 10 дней.

Результаты и обсуждение. В результате применения описанного метода снижается вероятность развития паратиреоидной недостаточности, повышается точность визуализации и сохранения паращитовидных желёз,не требуется применение радиоизотопов, данная методика легко воспроизводима.

Заключение: При применении данной методики удалось сохранить функцию паращитовидных желёз после удаления/резекции щитовидной железы у 71 из 74 пациентов.

Данные экспериментального и клинического этапа применения титановых пластин с биокерамическим покрытиями при реконструкции лицевого скелета

Решетов И.В., Штанский Д.В., Ратушный М.В., Филюшин M.M., Сухарев. С.С.

МНИОИ им.П.А.Герцена, Государственный институт Стали и Сплавов
(Технологический Университет), Москва, Россия

Лучевая и химиотерапия, необходимые при комплексном лечении опухолевой патологии значительно уменьшают регенираторые способности организма, и ведут в 10-15% к отторжению синтетических материалов применяемых при реконструкции костных дефектов челюстно-лицевой зоны. Для реконструкции тканевых дефектов, образующихся после обширных хирургических вмешательств в настоящее время используются различные методы алло- и аутотрансплантации, а так же осуществляется поиск и разработка новых биосовместимых материалов для восстановления дефектов.

Среди множества био материалов перспективными являются пористые керамические материалы на основе фосфатов кальция, в связи с их близостью по составу с внеклеточным веществом кости. Современные биоматериалы, используемые в реконструктивной хирургии должны обладать высокой прочностью, повышенной коррозийной и износостойкостью, хорошей биологической совместимостью и нетоксичностью.

В то время как многие металлы и сплавы соответствуют многим из этих требований, они обеспечивают достаточно неплотное соединение между металлической поверхностью и костной тканью. Для обеспечения наиболее эффективного контакта между костными фрагментами и имплантатом необходимо наличие многофункционального биологически активного наноструктурного покрытия на поверхности имплантата.

На базе МНИОИ им. П.А. Герцена проведены экспериментальные работы по имплантации в область костного дефекта титановых пластин с различными вариантами биокерамического напыления. На первом этапе использовались две группы крыс, каждая из которых включала четыре животных. Животным выполнялась трепанация теменной кости размером до 3-4 мм, с замещением костного дефекта титановой пластиной соответствующего размера с наноструктурным биокерамическим напылением и титаном без напыления.

Животные обеих групп выводились из эксперимента на 15 и 30 сутки с предварительным рентгенологическим исследованием и последующим морфологическим исследованием области хирургического воздействия. Данные рентгенологического исследования показали отсутствие патологической периостальной реакции, вокруг имплантации титана в обеих группах, и восстановление опорной функции резецированного косного фрагмента.

При гистологическом исследовании и электронной микроскопии имплантированных образцов титана (без напыления и с биокерамическим напылением) выявлено плотное заселение пористого биокерамического покрытия остеобластами с началом неоостеогенеза, подобной картины на поверхности титана без биокерамического покрытия не отмечено.

На втором этапе экспериментальной работы использованы крупные лабораторные животных, близких по своим массо-габаритным характеристикам к человеку. Для оценки остеоиндуктивных и механико-несущих потенций наноструктурированных покрытий титановых имплантов при остеосинтезе в области костного дефекта баранам выполняли остеотомию скуловой и локтевой костей. В послеоперационном периоде животные находились на стандартном пищевом и питьевом рационах.

Положение титановых пластин в области остеосинтеза контролировалось непосредственно в день имплантации посредством рентгенологического исследования, контроль положения имплантов, а также окружающих тканей, проводился в сроки 4 и 6 недель после операции. При рентгенологическом исследовании отмечается отсутствие признаков воспаления, периостальных реакций, патологической подвижности соединяемых фрагментов костей, формирование полноценной костной мозоли. Через 4 и 6 недель после операции фрагменты опорных конструкций (скуловой и локтевой костей животного) хирургически удалялись и подвергались гистологическому исследованию.

При сравнении с контрольной группой у животных с имплатированными титановыми наноструктурированными пластинами, через 4 недели в области перелома отмечается формирование костной мозоли с созреванием зрелой костной ткани, через 6 недель в области перелома отмечается выраженное формирование зрелой костной ткани без признаков нарушения целостности кости.

Таким образом нами разработана оптимальная экспериментальная модель для исследования механизмов остеоинтеграции и остеогенеза в области интеграции титановых имплантатов. Исследования средствами световой микроскопии показали тенденцию к ускорению остеогенеза в окрестности имплантов, имеющих наноструктурные покрытия. Электронная микроскопия и иммуногистохимические исследования позволят определить количественные характеристики остеогенеза и доказать преимущества имплантов с наноструктурными покрытиями.

Полученные в эксперименте данные позволили перейти к ограниченным клиническим испытаниям титановых наноструктурированных пластин при остеосинтезе костных структур челюстно-лицевой зоны у онкологических больных. На базе отделения микрохирургии МНИОИ им. П.А.Герцена проведены ограниченные клинические испытания перфорированных титановых пластин для остеосинтеза в черепно-челюстно-лицевой хирургии производства ООО «Конмет» (ТУ 9438-003-11458417-2004) с использованием композиционных СВС мишеней TiC0.5+10%Ca1O (ТУ 1984-015-11301236-2003) и TiC0.5+10%Ca10(PO4)6(OH)2 (ТУ 1984-019-11301236-2005) производства ЗАО НПО «Металл».

Испытания проведены на 20 пациентах находящихся на различных этапах специального лечения. Операции по остеосинтезу посредством перфорированных титановых пластин производства ООО «Конмет» осуществлялись по комбинированной анестезией в асептических условиях операционного блока МНИОИ им.П.А.Герцена. Предварительно все образцы подвергались стерилизации в аппарате холодной плазменной обработки в парах перекиси водорода в течении 50 мин. после предварительной упаковки в контейнер «stericlin».

Послеоперационный период оценивали: по клиническому течению раневого процесса (наличию отека и гиперемии слизистой оболочки в области хирургического вмешательства, состоятельности швов, общей температурной реакции организма), клинико-лабораторными показателям (общий анализ крови, биохимический анализ крови), рентгенологически – картина состояния области пластики костного дефекта и окружающих тканей). Во всех 20 случаях отмечено заживление операционной раны первичным натяжением; швы сняты на 10-14 сутки. Контрольный осмотр и рентгенологический контроль осуществляли согласно требованиям к срокам динамического наблюдения онкологических больных.

Перспективы применения наночастиц и гипертермии в лечении рецидивных нерезектабельных опухолей

Светицкий П.В., Енгибарян М.А., Златник Е.Ю., Горошинская И.А., Светицкий А.П., Качесова П.С.

ФГБУ «РНИОИ» МЗ и СР РФ, Ростов-на-Дону, Россия

Лечение нерезектабельных опухолей (ОП), исчерпавших возможности химио-лучевой терапии, является одной из сложнейших проблем клинической онкологии. Возможности лучевой терапии у этих больных исчерпаны и лечение приобретает паллиативный характер.

Цель наших исследований: улучшить результаты лечения больных данной категории. В настоящее время, для потенцирования химиотерапии и облучения, используется гипертермия (ГТ), которая в основном осуществляется посредством электромагнитного (ЭМ) излучения.

К сожалению, не всегда удается добиться желаемых результатов. Одна из главных причин заключается в том, что ОП ткань по своей структуре неоднородная. Распространенные рецидивные раковые ОП включают некротическую ткань, рубцы и участки фиброза, особенно выраженные после облучения. Эти ткани проявляют свойства диэлектрика, что снижает эффективность электромагнитного воздействия и, следовательно – ГТ. В этом плане нас привлекли возможности использования свойств наночастиц (НЧ), не только как противоопухолевых агентов, но и для потенцирования модификатора химиотерапии – ГТ. Клиническому лечению предшествовали экспериментальные исследования.

Брались фрагменты ОП больных раком гортани, полости рта и шейных метастазов, которые обрабатывались и инкубировались с НЧ металла (Ag) в условиях ЭМ ГТ и без неё. После инкубации подсчитывали количество погибших клеток. Была установлена частичная гибель ОП клеток под воздействием только НЧAg и только ЭМ ГТ, тогда как при использовании ЭМ ГТ+НЧАg наблюдалась тотальная гибель ОП клеток.

Крысам с перевивной ОП (С-45) интратуморально вводилась суспензия НЧ железа, а паратуморально – антиметаболит (метотрексат), после чего ОП подвергались ЭМ ГТ. Другой группе животных проводили лечение без НЧ. Результаты исследований показали, что у животных подвергнутых ЭМГ ГТ, ХТ и воздействию НЧ торможение роста ОП было в 2 раза выше, чем без включения НЧ.

Таким образом, in vitro НЧ металлов в условиях ГТ вызывают выраженный цитотоксический эффект на ОП клетки, а их сочетание с цитостатиком увеличивает торможение экспериментальных ОП. Исследования продолжаются.

Фемтосекундная лазерная микрохирургия различных клеток и доимплатационных эмбрионов млекопитающих

Шахбазян А., Karmenyan А., Кривохарченко А., Саркисов О.

Разработаны методы неинвазивной или малоинвазивной фемтосекундной лазерной микрохирургии и ее использование для получения индивидуальных эмбриональных стволовых клеток. Уникальная установка включает три лазера (непрерывный, фемтосекундный и полупроводниковый) и оснащена оборудованием, позволяющем использовать атомно-силовую микроскопию, регистрировать флуоресцентные спектры и интегральную люминесценцию, а также осуществлять непрерывную видео регистрацию в процессе лазерных процедур.

Для подбора оптимальных условий проведения микрохирургических манипуляций, в установке отработана возможность изменения различных параметров лазерного луча (мощности излучения, длительности импульса, чирпирование импульса, экспозиция облучения).

Возможности новой фемтосекундной технологии микрохирургии продемонстрирована на различных примерах: многоскальпельной микрохирургии ядерных эритроцитов голубя и нейронов, слиянии клеток и ооцитов. Для примера показано слияние трех клеток (бластомеров) внутри 4-клеточного эмбриона.

Рис. 1. Лазерное слияние с образованим трехядерных клеток внутри эмбриона.

Слева показан 4-клеточный эмбрион мыши с видимым контактом между тремя бластомерами. В середине эмбрион с одной нормальной и одной большой клеткой, образовавшейся после слияния трех бластомеров. Справа показана флуоресценция трех ядер с использованием витального красителя Hoechst 33342. Флуоресценция свидетельствует, что разрушения ядер не произошло.

Из рисунка видно, что мембрана также не разрушена. Сегодня основным методом слияния клеток является метод электрослияния. Этот метод может разрушать мембрану и не позволяет делать выбор клеток для слияния. В наших же экспериментах впервые в мире продемонстрировано лазерное слияние двух и трех клеток внутри 4-клеточного мышиного эмбриона без разрушения мембраны и жизнеспособности эмбриона.

Развиваемая лазерная микрохирургия использовалась для создания технологии получения индивидуальных эмбриональных стволовых клеток. В качестве источника цитопластов использовали яйцеклетки (ооциты) на стадии метафазы II мышей, а в качестве источника донорских ядер использовали клетки кумулюса или фибробласты мышей. Ключевыми этапами клонирования являются: инактивация фемтосекундным лазерным излучением хромосомной пластинки ооцита; вырезание в блестящей мембране пространства для введения соматической клетки в перевителиновое пространство; оптическое перемещение соматической клетки с нужным геномом до контакта с ооцитом; лазерное слияние ооцита с соматической клеткой.

В результате получается реконструированный эмбрион с желаемым геномом. Развиваемая нами технология должна обеспечить эффективность так называемого процесса репрограмирования с последующим развитием реконструированного эмбриона. Новизна развиваемого подхода заключается в том, что все этапы проводяться только лазерными методами без использования механических, электрических и химических процедур.

Металлические и металлокерамические биосовместимые покрытия с контролируемыми топографией, открытой пористостью и составом поверхности

Штанский Д.В.¹, Батенина И.В.¹, Ядройцев И.А.², Ряшин Н.С.², Кудряшов А.Е.¹, Шевейко А.Н.¹, Погожев Ю.С.¹, Смуров И.Ю.², Левашов Е.А.¹

¹ Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС»,
² Национальная Инженерная Школа Сент-Этьенна.

Возможность установления прочной микромеханической и химической связи между поверхностью искусственного имплантата и костной тканью является одной из важнейших характеристик современных биоматериалов, предназначенных для ортопедии, реконструкционной хирургии и стоматологии. Взаимодействие поверхности имплантата с окружающими тканями – сложный динамический процесс, эффективность которого во многом зависит от химических и топографических характеристик поверхности имплантата.

Ранее было показано, что элементный состав поверхности имплантата играет важную роль на различных этапах взаимодействия остеобластов с их поверхностью, в то время как изменения рельефа поверхности в диапазоне Sq=0.4-1 мкм не оказывают существенного влияния на адгезию, пролиферацию и дифференцировку остеобластов [1].

Целью данной работы является получение и исследование покрытий с различным элементным составом и топографией поверхности в диапазоне среднеквадратичного значения шероховатости Ra=1-100 мкм. Для получения покрытий с различной шероховатостью поверхности использовались методы холодного газодинамического напыления (ХГН), селективного лазерного спекания (СЛС) и электроискрового легирование (ЭИЛ). Для изменения элементного состава, на поверхность образцов осаждалось многокомпонентное биоактивное наноструктурированное покрытие (МБНП) методом магнетронного распыления (МР) композиционной мишени.

В процессе ХГН на обрабатываемую поверхность сверхзвуковым потоком газа (500-1000 м/с) нагретым до температуры 250-500°С наносили частицы порошка титана марки Grade 2 с размером частиц 20-35 мкм. За счет реализации низких температур метод ХГН исключает окисление расплавленного материала, что позволило получить однородные поверхности в широком диапазоне параметра Ra=4-80 мкм.

Методом ЭИЛ за счет электрической эрозии и полярного переноса материала с анода (электрода) на катод (подложка-имплантат) при протекании импульсных разрядов в газовой среде были получены покрытия с шероховатостью Ra=3-8 мкм. В методе СЛС порошковый материал послойно спекался лазерным излучением. За счет варьирования расстояния между треками методом СЛС были получены покрытия с различной открытой пористостью.

Топография поверхности покрытий, полученных методами ХГН, ЭИЛ и СЛС показана на рисунке 1.

Рис. 1. Топография поверхности покрытий

С целью изменения химического состава поверхности при сохранении заданной топографии использовался метод магнетронного распыления композиционных мишеней, позволяющий наносить тонкий поверхностный слой МБНП. Это покрытие повторяет рельеф ранее сформированной поверхности. В настоящей работе в качестве финишного поверхностного слоя использовалось покрытие TiCaPCON, которое обладает хорошими биологическими характеристиками [2].

Показано, что комбинация методов ХГН, СЛС, ЭИЛ и МР позволяет получать биосовместимые покрытия с контролируемыми топографией, открытой пористостью и составом поверхности. Данные материалы предназначены для последующего изучения адгезии, пролиферации и дифференцировки остеобластов.

Работы выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки (ГК 16.513.11.3092).

1. Д.В. Штанский, И.Ю. Житняк, И. А. Башкова, Ю.С. Погожев, А.Н. Шевейко, Н.А. Глушанкова, Биологические мембраны, издательство “Наука-Interperiodica”, 27(4) (2010) 325-330.
2. D.V. Shtansky, N.A. Gloushankova, I.A. Bashkova, M.A. Kharitonova, T.G. Moizhess, A.N. Sheveiko, F.V. Kiryukhantsev-Korneev, M.I. Petrzhik, E.A. Levashov, Biomaterials, 27 (2006) 3519-3531.

• Редколлегия журнала
• Оформление публикаций

Издательство
«Бионика Медиа»

Москва, ул. Профсоюзная, 57
(в здании НИИ "Полиграф")
Тел.: +7(495) 786-25-57
E-mail:
URL: bionika-media.ru